DB21/T 3111—2019
水质肠球菌的测定
固定底物技术酶底物法

前言
本标准依据GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》起草制订。本标准附录A为规范性附录。
本标准由大连市市场监督管理局提出。本标准由辽宁省生态环境厅归口。本标准起草单位：大连市环境监测中心、国家海洋环境监测中心。本标准主要起草人：王中卫、明红霞、李翔宇、沈学崴、李玉璞、苏洁、曲翊、王琳琳、刘子成、孙沛雯、刘景泰、韩佳。

1 范围
本标准规定了测定水中肠球菌的固定底物技术酶底物法。本标准适用于地表水、地下水、饮用水、海水、生活废水和工业废水中肠球菌的测定。本标准的检出限：地表水、地下水、饮用水、生活废水、工业废水样品的检出限为1 CFU/100ml，海水样品的检出限为10 CFU/100ml。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 5750.2 生活饮用水标准检验方法 样品的采集与保存
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 17378.7 海洋监测规范 第七部分：近海污染生态调查和生物监测
HJ/T 164 地下水环境监测技术规范
HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范

3 术语和定义
下列术语和定义适用于本标准
3.1 肠球菌 Enterococci
41℃培养24h，能产生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase），分解选择性培养基中的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（4-methylumbellyl-β-D-glucoside, MUG）释放出荧光物质（4-甲基伞形酮）的革兰氏阳性菌。
3.2 最大可能数 most probable number (MPN)
又称稀释培养计数，是一种基于泊松分布的间接计数法。利用统计学原理，根据一定体积不同稀释度样品经培养后产生的目标微生物阳性数，查表估算一定体积样品中目标微生物存在的数量（单位体积存在目标微生物的最大可能数）。

4 方法原理
在特定温度下培养特定的时间，肠球菌能产生β-半乳糖苷酶，分解荧光底物释放出荧光产物，在366nm紫外灯照射下产生特征性荧光。统计荧光反应出现数量，查MPN表，计算样品中肠球菌的浓度值。

5 试剂和材料
除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，符合GB/T 6682三级标准的蒸馏水或去离子水。
5.1 培养基
市售Enterolert培养基，也可以使用其他等效产品。
5.2 硫代硫酸钠溶液：$ ho(Na_2S_2O_3 cdot 5H_2O) = 0.10 ext{g/ml}$。称取硫代硫酸钠($Na_2S_2O_3 cdot 5H_2O$) 10.0g，溶于适量实验用水，定容至100ml，临用现配。
5.3 乙二胺四乙酸二钠溶液：$ ho(Na_2EDTA cdot 2H_2O) = 0.15 ext{g/ml}$。称取乙二胺四乙酸二钠($Na_2EDTA cdot 2H_2O$) 15.0g，溶于适量实验用水，定容至100ml，此溶液保质期为30d。
5.4 无菌水
实验用水经121℃高压蒸汽灭菌20min，备用。

6 仪器和设备
6.1 恒温培养箱：能使温度升至41℃，控温精度0.5℃。
6.2 一般实验室常用仪器和设备。
6.3 紫外灯：台式，366nm。
6.4 封口机：用于定量盘的封口。
6.5 采样瓶：具螺旋帽或磨口塞的250ml玻璃瓶。
6.6 三角瓶：100ml。
6.7 96孔定量盘。