ICS 65.150
B51
DB21 辽宁省地方标准
DB21/T 3120—2019
水产动物物种分子鉴定 COI、16S rRNA 分子标记法
Technical specification for species molecular identification using COI and 16S rRNA of aquatic animals

2019-02-28 发布
辽宁省市场监督管理局
2019-03-28 实施

前言
本标准依据 GB/T 1.1—2009 给出的规则制定。本标准由大连市质量技术监督局提出，由辽宁省农业农村厅归口。本标准主要起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院。本标准主要起草人：高磊、赫崇波、鲍相渤、高祥刚。附录 A、B、C 为资料性附录。

1 范围
本标准规定了水产动物物种分子鉴定 COI、16S rRNA 分子标记法的术语和定义、标记方式、试剂、仪器和设备、样品采集、保存与前处理、DNA 提取与检测、序列扩增与测序以及物种鉴定方法。
本标准适用于水产动物物种分子鉴定。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期版本适用；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括修改单）适用。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

3 术语和定义
3.1 水产动物物种分子鉴定
指利用分子生物学手段，对水产动物样本（尤其适用于形态学特征相近、模糊或缺失的样本）进行分子标记分析，从而鉴定生物种类的过程。

3.2 聚合酶链式反应（PCR）
聚合酶链式反应是一种在体外扩增特异 DNA 片段的技术。利用一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）为原料，在适宜温度、离子条件及耐热 DNA 聚合酶作用下进行扩增反应。

3.3 DNA 序列测定
测定 DNA 分子的核苷酸序列。

3.4 序列比对
为确定两个或多个序列之间的相似性与同源性，按照一定规则对序列进行排列分析。

3.5 DNA 条形码 COI
细胞色素 c 氧化酶亚基 I（cytochrome c oxidase subunit I）。

3.6 16S rRNA
16S 核糖体核糖核酸（16S ribosomal RNA）。

4 标记方式
水产动物 COI 和 16S rRNA 基因序列进化速度适中且具有保守性，可作为分子条形码用于物种鉴定。通过 PCR 技术扩增 COI 和 16S rRNA 基因部分序列，经测序后在数据库中进行比对以确定物种信息。本方法同时在 GenBank 和 BOLD Systems 数据库中进行比对，以提高鉴定准确性。

5 试剂、仪器和设备
5.1 试剂
实验用试剂均为分析纯，水应符合 GB/T 6682 一级水要求。主要包括：无水乙醇、95%乙醇、TE 缓冲液（pH7.6）、Taq DNA 聚合酶、超纯水、PCR 缓冲液、引物、dNTP 混合液、溴化乙锭、琼脂糖、电泳标记物、平衡酚、氯仿/异戊醇（24:1）、TBE 电泳缓冲液、灭菌蒸馏水、液氮、细胞裂解液等。

5.2 仪器和设备
凝胶成像分析系统、PCR 扩增仪、低温高速离心机（4℃，12000 rpm）、电泳仪、电泳槽、移液器、电子天平（0.001g）、水浴恒温振荡器、紫外分光光度计、遗传分析仪等。

6 样品采集、保存与前处理
6.1 样品采集与保存
样本采集及后续实验应在生物安全实验室进行。优先选择 DNA 含量高、杂质含量低的肌肉或肠道组织作为实验材料。