DB37/T1780—2011
水产苗种中孔雀石绿、结晶紫、亚甲基蓝及其代谢物残留量的测定 液相色谱法

发布日期：2011-01-06
实施日期：2011-03-01
发布单位：山东省质量技术监督局

前言
本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省海洋与渔业厅提出。本标准由山东省海洋渔业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省海洋水产研究所、山东省水产品质量检验中心。
本标准主要起草人：宫向红、刘义豪、刘慧慧、徐英江、秦华伟、任传博、邹荣婕、邓旭修。

1 范围
本标准规定了水产苗种中孔雀石绿(MG)、结晶紫(CV)、亚甲基蓝(MB)及其代谢物残留量的液相色谱测定方法。
本标准适用于水产苗种中孔雀石绿、结晶紫、亚甲基蓝及其代谢物（隐色孔雀石绿(LMG)、隐色结晶紫(LCV)、天青A(AZ-A)、天青B(AZ-B)、天青C(AZ-C)）残留量的测定。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
《水产苗种违禁药物抽检技术规范》农业部1192号公告-1-2009

3 原理
样品中残留的孔雀石绿、结晶紫、亚甲基蓝及其代谢物用乙腈-乙酸铵缓冲液提取，二氯甲烷液液萃取，固相萃取柱净化，反相色谱柱分离，紫外检测器检测，外标法定量。

4 试剂
4.1 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，试验用水符合GB/T 6682一级水的标准。
4.2 乙腈：色谱纯。
4.3 二氯甲烷：色谱纯。
4.4 甲醇：色谱纯。
4.5 甲酸。
4.6 冰乙酸。
4.7 二甘醇。
4.8 氨水。
4.9 乙酸铵。
4.10 盐酸羟胺。
4.11 对-甲苯磺酸。
4.12 20%盐酸羟胺溶液：称取盐酸羟胺20g，溶解于100mL水中。
4.13 1.0 mol/L对-甲苯磺酸溶液：称取对-甲苯磺酸19.0g，溶解于100mL水中。
4.14 0.125 mol/L乙酸铵缓冲溶液：称取9.64g乙酸铵溶解于1000mL水中，冰乙酸调pH到4.5。
4.15 定容液：乙腈+乙酸铵缓冲溶液（20:80, v/v）。
4.16 标准品：孔雀石绿(MG)、结晶紫(CV)、亚甲基蓝(MB)、天青A(AZ-A)、天青B(AZ-B)、天青C(AZ-C)、隐色孔雀石绿(LMG)、隐色结晶紫(LCV)，纯度均大于98%。
4.17 标准储备溶液：准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫标准品，用乙腈分别配制成100μg/mL的标准储备溶液；准确称取适量的亚甲基蓝、天青A、天青B、天青C标准品，用甲醇分别配制成100μg/mL的标准储备溶液。-18℃避光保存，有效期6个月。
4.18 混合标准中间液(1.0μg/mL)：分别准确吸取1.00mL亚甲基蓝、天青A、天青B、天青C、孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的标准储备溶液至100mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成1.0μg/mL的混合标准中间液。-18℃避光保存，有效期1个月。
4.19 混合标准工作溶液：根据需要，临用时准确吸取一定量的混合标准中间液，用定容液准确稀释至适当浓度。
4.20 洗脱液A：甲醇50mL，二氯甲烷50mL，氨水5mL，或按其比例，混匀。
4.21 洗脱液B：洗脱液A 100mL，加甲酸1mL，或按其比例，混匀。

5 仪器与设备
5.1 高效液相色谱仪：配紫外检测器。
5.2 电子天平：感量0.00001g。
5.3 天平：感量0.01g。
5.4 离心机：4000r/min。
5.5 旋涡振荡器。
5.6 固相萃取装置。
5.7 旋转蒸发仪。
5.8 固相萃取小柱：DSC-MCAX，300mg，3mL；或与之相当者。
5.9 氧化铅柱：35mm×4.6mm（内径），柱内填料：氧化铅+硅藻土（1+1）。

6 测定步骤
6.1 样品制备
按照《水产苗种违禁药物抽检技术规范》执行。
6.2 提取
称取10g（精确至0.01g）样品于50mL离心管内，加入对-甲苯磺酸溶液（4.11）1.5mL，对-甲苯...