ICS65.120 B20 DB41 河南省地方标准 DB41/T1728—2018 饲料添加剂丁酸梭菌的测定 微生物法 2018-11-26发布 河南省质量技术监督局发布 2019-02-26实施 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局提出并归口。本标准起草单位：河南海瑞正检测技术有限公司、河南省兽药饲料监察所、河南省种牛遗传性能测定中心。本标准主要起草人：朱慧慧、陆静、方忠意、李灵平、周永亮、黄好强、麻晓燕、王洋洋、范晓燕、魏金销。 1 范围 本标准规定了饲料添加剂中丁酸梭菌的检测方法（微生物法）。 本标准适用于饲料及饲料添加剂中丁酸梭菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡注日期的引用文件，仅注日期的版本适用；凡不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定 3 培养基或材料 3.1 亚硫酸铁琼脂培养基（见附录A中A.1） 3.2 0.85%生理盐水（见附录A中A.2） 3.3 产酸指示培养基（见附录B中B.1） 3.4 明胶培养基 3.5 淀粉水解培养基 3.6 革兰氏染色配套试剂（见附录A中A.3） 3.7 胰蛋白胨大豆琼脂（TSA） 注：除非另有说明，试验用试剂应为分析纯，水应符合GB/T 6682三级水要求。 4 仪器设备 4.1 天平（感量0.01g） 4.2 粉碎机 4.3 高压灭菌器 4.4 恒温培养箱 4.5 电热鼓风干燥箱 4.6 拍击式匀质器 4.7 厌氧罐（配厌氧产气袋） 4.8 超净工作台 4.9 移液器（100～1000μL） 4.10 显微镜 4.11 酒精灯 4.12 试管架 4.13 灭菌试管（15mL） 4.14 灭菌平皿（直径90mm） 5 测定步骤 5.1 试样稀释及培养 5.1.1 无菌条件下称取试样25g（或25mL），加入225mL 0.85%灭菌生理盐水的匀质袋中，拍打2min～3min制成1:10均匀稀释液。 5.1.2 吸取1mL 1:10稀释液加入9mL灭菌生理盐水中，混匀制成1:100稀释液。 5.1.3 按上述方法进行10倍系列递增稀释。 5.1.4 选择2～3个适宜稀释度，每个稀释度取1mL于灭菌平皿中，重复两皿，并设无菌对照。加入50℃左右培养基混匀。 5.1.5 培养基凝固后倒置培养，37℃厌氧培养18h～24h，观察菌落形态。 5.2 菌落特征 在亚硫酸铁琼脂培养基上，菌落圆形、较小、规则、实心，初期为黑色，放置1～2d后黑色逐渐褪为白色。 5.3 确证试验 挑取特征菌落进行纯化，在胰蛋白胨大豆琼脂上培养。进行革兰氏染色和生化试验：菌体为革兰氏阳性杆状，可形成圆形或椭圆形芽孢，菌体中部膨大呈梭形。不水解明胶，可水解淀粉，可利用蜜二糖和葡萄糖产酸，不利用松三糖、鼠李糖和山梨醇，即判定为丁酸梭菌。 6 结果计算与报告 6.1 单平板菌落数计算 按公式计算：a = b × c / A（结果按GB/T 8170修约至整数） 其中：a为单平板丁酸梭菌菌落数；b为确证菌落数；c为特征菌落总数；A为挑选菌落数。 6.2 样品菌数计算 选择两个连续稀释度平板（菌落数30～300），按公式计算样品中丁酸梭菌数量N。 N = Σa / [(n1 + 0.1n2) × d] 其中：N为样品菌数；Σa为确证菌落总数；n1、n2为不同稀释度平均菌落数；d为稀释因子。