ICS 65.020.20
B05
DB13 河北省地方标准
DB13/T2404—2016
猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法
2016-09-30发布
河北省质量技术监督局发布
2016-12-01实施

前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由河北省畜牧局提出。本标准起草单位：河北农业大学。本标准主要起草人：袁万哲、孙继国、宋勤叶、马增军、金东航、李丽敏、张磊、李睿文。

1 范围
本标准规定了猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的技术要求。本标准适用于检测猪粪便、腹泻猪胃肠及其内容物以及相关培养物中的猪流行性腹泻病毒。

2 缩略语
DEPC：焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate）；dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate）；EB：溴化乙锭（ethidium bromide）；PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）；RNA：核糖核酸（ribonucleic acid）；RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction）；Vero细胞：非洲绿猴肾细胞；cDNA：互补脱氧核糖核酸。

3 主要仪器
PCR仪；凝胶成像系统；台式低温高速离心机；电泳仪；电泳槽；冰箱；微量移液器；水浴锅。

4 主要试剂
LST TRIzol RNA提取试剂或其他RNA提取试剂；氯仿；1.0%琼脂糖凝胶（见附录A）；50×TAE缓冲液（见附录A）；EB或核酸染料（见附录A）；DEPC处理的无RNA酶双蒸水（见附录A）；DNA分子量标准（100 bp）；反转录酶；RNA酶抑制剂；2×Taq Master Mix；dNTP；一步法RT-PCR反应试剂（含缓冲液、酶混合物、dNTP及无RNA酶水等）。

5 引物
上游引物与下游引物见附录B，引物浓度为10 μmol/L。

6 样品对照
阳性对照：灭活猪流行性腹泻病毒Vero细胞培养物或感染样品；阴性对照：正常Vero细胞培养物或健康猪粪便及肠组织样品。

7 操作步骤
7.1 样品采集与处理
采集工具需121℃±2℃高压灭菌20 min后使用，包括棉拭子、剪刀、镊子、1.5 mL离心管及研钵等。

粪便采集：用棉拭子采集肛门粪便，置于含1.0 mL PBS的离心管中编号保存。

胃或肠及内容物采集：剪取组织样品后密封保存并编号。

样品运输：样品密封后置于冰盒中，24 h内送实验室。

7.1.5 样品处理
棉拭子处理：振荡后离心3000 r/min 15 min，取上清备用。

胃肠样品处理：按1:1加入样品保存液研磨，离心后取上清备用。

7.2 RNA提取
使用TRIzol法提取RNA。取250 μL样品加入750 μL TRIzol，振荡2 min，室温放置5 min。加入250 μL氯仿振荡1 min，室温放置5 min，4℃ 12000 r/min离心15 min。取上清加入等体积异丙醇混匀，室温放置15 min后再次离心（4℃ 12000 r/min，时间未完整记录）。