ICS 07.060;13.060 Z 17 HY 中华人民共和国海洋行业标准 HY/T 176—2014 海水中铁细菌的测定（MPN法） Determination of iron bacteria in seawater — MPN method 发布日期：2014-06-25 实施日期：2014-12-01 发布单位：国家海洋局 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家海洋局天津海水淡化与综合利用研究所提出，由全国海洋标准化技术委员会（SAC/TC283）归口。本标准由国家海洋局天津海水淡化与综合利用研究所、浙江国华浙能发电有限公司负责起草。主要起草人：李亚红、张益、陈冲、吴彭杰、周筝、张连涛、元吴、赵小芳、郭景静。 1 范围 本标准规定了海水中铁细菌的MPN测定方法，适用于海水及海水利用过程中产生的浓海水中铁细菌的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 16310.1—1996 船舶散装运输液体化学品危害性评价规范 3 术语和定义 3.1 铁细菌（iron bacteria） 指一类能将溶于水中的亚铁离子转化为不溶性三氧化二铁水合物（呈褐色或黑色沉淀）的细菌。 3.2 MPN法（most probable number method） 采用多管发酵技术，基于概率理论估算样品中细菌浓度的方法。 3.3 陈海水（aged seawater） 指取自未污染海域，装入玻璃瓶后在暗处储存15天以上的海水。 4 方法原理 采用多管发酵技术，将样品在（29±1）℃条件下培养14天。若试管中棕色消失并形成褐色或黑色沉淀，则判定为阳性反应。通过MPN法对样品中铁细菌数量进行估算。 5 试剂与材料 除另有规定外，所有试剂应为分析纯，实验用水应符合GB/T 6682中三级水标准。所需试剂与材料包括： 硫酸镁、硫酸铵、磷酸氢二钾、无水氯化钙、硝酸钠、柠檬酸铁铵、硫代硫酸钠、陈海水、人工海水（按GB/T 16310.1—1996配制）、氢氧化钠溶液（160 g/L）、盐酸溶液（1+11）、牛皮纸。 6 仪器与设备 包括： 无菌箱（室）或超净工作台；蒸汽压力灭菌器；生化培养箱（29±1℃）；电热干燥箱（60℃～280℃，允差±2℃）；恒温水浴锅（37℃～100℃，允差±1℃）；天平（0～220g，感量0.01g）；冰箱；振荡器；刻度吸管或移液器（1mL、10mL）；量筒（500mL、1000mL）；烧杯（1000mL）；无菌试管（直径18mm，长度180mm，配硅胶塞）；无菌吸管或移液器及Tip头；无菌采样瓶（玻璃或聚丙烯材质）；试管架；pH计或精密pH试纸（范围6.4～8.0）。 注：上述无菌器具需在121±1℃下灭菌20min后烘干备用。 7 试验前准备 7.1 培养基的配置 7.1.1 成分（每升含量）： 硫酸镁0.50g，硫酸铵0.50g，磷酸氢二钾0.50g，无水氯化钙0.20g，硝酸钠0.50g，柠檬酸铁铵10.00g。 7.1.2 制备方法 将上述试剂溶解于500mL海水和500mL蒸馏水的混合液中，用氢氧化钠溶液（160g/L）或盐酸溶液（1+11）调节pH至6.8±0.2。分装于试管中，每管5mL～10mL，在110±1℃条件下灭菌30min，冷却备用。 7.2 无菌稀释水的制备 将陈海水或人工海水分装于试管中，每管9mL，在121±1℃条件下灭菌20min，冷却备用。 7.3 硫代硫酸钠的处理 将硫代硫酸钠置于无菌箱内，在距离紫外线灯30cm处均匀摊放进行灭菌处理。