DB22/T2912—2018
贝类中霍乱弧菌检测微滴数字PCR法
Determination of Vibrio cholerae in shellfish - droplet digital PCR method

ICS67.120.30
发布日期：2018-11-12
实施日期：2018-12-30
发布单位：吉林省市场监督管理厅

前言
本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由长春海关（原吉林出入境检验检疫局提出并归口）。
本标准起草单位：长春海关（原吉林出入境检验检疫局验检疫技术中心）、延边海关综合服务技术中心（原延边出入境检验检疫局技术中心）。
本标准主要起草人：罗雁非、孙佳、杜佳剑、聂丹丹、丁旭、王准、曲辉、彭勃。

警示
使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。

1 范围
本标准规定了贝类中霍乱弧菌检测微滴数字PCR法的试剂和材料、仪器和设备、样品、试验步骤和试验数据处理与防止污染措施，本标准适用于贝类中霍乱弧菌检测。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB4789.1-2016 食品安全国家标准 食品卫生微生物检验总则
GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB19489 实验室生物安全通用要求
GB/T19495.3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法
SN/T1022 进出口食品中霍乱弧菌检验方法
SN/T2425-2010 进出口食品中霍乱弧菌快速及鉴定监测方法 实时荧光PCR方法
WS/T230-2002 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用

3 原理
微滴式数字PCR平台通过产生微小油包水体系实现反应体系的分割，根据霍乱弧菌的溶血性特异性基因序列对贝类中霍乱弧菌进行鉴定。经PCR扩增后，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度，实现对霍乱弧菌的快速定性检测。

4 试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB/1668中级水的要求。
4.1 裂解液，成分包括：2% CTAB（cetyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），100 mmol/L Tris（trishydroxymethylaminomethane，三羟甲基氨基甲烷），1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA（ethylenediaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸），用 HCl 调至 pH 8.0。
4.2 酚/氯仿/异戊醇（25:24:1, v/v/v）。
4.3 氯仿。
4.4 异戊醇。
4.5 无水乙醇。