ICS 65.020.01 CCS B21 DB63 青海地方标准 DB63/T 2288—2024 青稞品种鉴定技术规程（SNP分子标记法） 2024-06-19 发布 青海省市场监督管理局 2024-07-25 实施 前言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由青海省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：中国科学院西北高原生物研究所、青海省农作物种子站、海南州农牧业综合服务中心、青海省乡村产业发展指导中心。 本文件主要起草人：王寒冬、沈裕虎、王蕾、徐金青、边海燕、韩文婷、李春桥、薛明珍、王焕强、李俊仁、包天忠、赵璨、王健斌、陈同睿、尤恩、邓超。 本文件由青海省农业农村厅监督实施。 1 范围 本文件规定了青稞（Hordeum vulgare L. var. nudum Hook.f.）品种鉴定SNP分子标记方法的术语和定义、缩略语、仪器设备及试剂、溶液配制、KASP引物信息、引物选择、操作程序、数据记录与统计及结果应用等技术要求。 本文件适用于青稞品种及种质资源的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 凡是注日期的引用文件，仅该日期对应版本适用；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 3543.4 农作物种子检验规程 发芽试验 GB/T 3543.5 农作物种子检验规程 真实性和品种纯度鉴定 GB 4404.1 粮食作物种子 第1部分：禾谷类 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法 GB/T 30988 多酚类植物基因组DNA提取纯化及测试方法 3 术语和定义 3.1 推荐引物 用于本文件规定的品种及种质资源鉴定的参照品种所使用的引物。 3.2 SNP位点等位变异品种 在所检测SNP位点上具有不同等位基因变异的品种。 3.3 送检样品 送至种子检验机构进行检验的样品。 3.4 试验样品 在实验室中从送检样品中分离用于检测的部分样品。 4 缩略语 DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribo Nucleic Acid） KASP：竞争性等位基因特异性PCR（Kompetitive Allele Specific PCR） PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction） SNP：单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism） 5 仪器设备及试剂 仪器设备及试剂见附录A，所用试剂均为分析纯。 实验用水应符合 GB/T 6682 要求。 6 溶液配制 见附录B。 7 KASP引物信息 分为I、II两组，见附录C。 8 KASP引物选择 首先选择附录C中I组引物进行扩增。当样品间检测出的差异位点数小于2时，选用I、II组全部引物进行扩增。 9 操作程序 9.1 样品准备 送检样品质量应符合 GB 4404.1 中大麦种子纯度要求。 试验样品分样按 GB/T 3543.2 执行。 发芽试验按 GB/T 3543.4 执行，供试籽粒不少于50粒。 植株长至三叶一心时采集叶片作为检测样品。 9.2 DNA样品制备 采用 GB/T 19495.3 方法或商用植物DNA提取试剂盒进行DNA提取。 每个送检品种DNA样品数量不少于50个单株，单提单检。 DNA纯度与浓度检测应符合 GB/T 30988 规定。 9.3 实时荧光定量PCR仪SNP分型 操作流程如下： （1）将2 μL DNA样品编号后加入96孔PCR板对应孔位，同时设置2个阴性对照（以超纯水替代DNA，其余一致）。每块PCR板检测一个送检品种。 （2）根据样品数量配制KASP基因分型混合液，所有试剂使用前需充分涡旋振荡。