ICS 11.220 B41 DB34 安徽省地方标准 DB34/T 3208—2018 羊传染性脓疮病毒分离鉴定技术规程 Technical Regulation for Isolation and Identification of Goat Contagious Ecthyma Virus 发布：2018-10-20 实施：2018-11-20 发布单位：安徽省质量技术监督局 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由安徽农业大学提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽农业大学、安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽东方帝维生物制品股份有限公司、安徽省动物卫生监督所、阜阳市动物卫生监督所、亳州市焦城区畜牧兽医局、德县畜牧兽医局、阜南县动物疫病预防与控制中心、肥东县动物疫病预防与控制中心、宿州市动物疫病预防与控制中心。 本标准主要起草人：王桂军、占松鹤、李雪松、祁克宗、朱良强、张星、张利亚、涂健、徐前明、方保根、冯育宁、陈静、郑举、方定平、兰梦蝶、刘雪梅、周迎春、王军、王楠楠、杨德康、车跃光。 1 范围 本标准规定了羊传染性脓疮病毒的病料采集与处理、病毒分离及病毒鉴定的技术要点。 本标准适用于羊传染性脓疮病毒的分离与鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 试验材料、试剂和仪器 3.1 材料 增殖表皮癌细胞（HeLa）、羊睾丸原代细胞（Lamb testis cells，LT）、DMEM培养基、M199液体培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、pH 7.0～7.4的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）、青霉素、链霉素。 3.2 试剂 DNA提取试剂盒、50×TAE缓冲液、琼脂糖。 3.3 仪器 细胞培养箱、生物安全柜、高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、紫外凝胶成像系统。 4 样品采集与处理 4.1 样品的采集 按照NY/T 541的规定执行，无菌采集疑似感染羊传染性脓疮病毒的病羊口唇、蹄部痂皮等病料。 4.2 样品的保存 样品应置于-80℃条件下冷冻保存。 4.3 样品的处理 将病料组织剪碎并充分研磨，用灭菌PBS按体积质量比5:1制备匀浆。将匀浆进行冻融处理（-80℃冷冻后于室温融解）反复三次。随后以5000 r/min离心10 min，取上清液，加入青霉素和链霉素使终浓度为2000 IU/mL，经0.22 μm滤膜过滤除菌后，置于-80℃保存备用。