ICS 65.120 B46 辽宁省地方标准 DB21/T 2742—2017 饲料中动物源性成分——貂源性组织成分定性检测方法（PCR方法） Animal derived ingredients in feed—Qualitative detection of mink tissue derived ingredients with PCR method 2017-02-23发布 2017-03-23实施 辽宁省质量技术监督局 发布 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009和GB/T 20001.4—2015给出的规则起草。 本标准由辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心提出。 本标准由辽宁省质量技术监督局归口。 本标准起草单位：辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心。 本标准主要起草人：李欣南、韩镌竹、许彬、李洪伟、高红倩、韩春晓、高铎、武凤娇、董娜。 本文件的部分内容可能涉及专利，发布机构不承担识别责任。 1 范围 本标准规定了检测饲料中貂源组织成分的聚合酶链式反应（PCR）检测方法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料中貂源性成分的检测。 本方法对貂源性成分的检测限为0.5%（w/w）。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期版本适用；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料采样 GB/T 19495 转基因产品检测 GB/T 20195 动物饲料试样的制备 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 3 原理 采用氯仿抽提法或等效基因组DNA提取试剂盒提取DNA，以提取DNA为模板进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。必要时对PCR产物进行限制性内切酶酶切及测序确认。 4 试剂和材料 除另有规定外，所用试剂为分析纯或生化试剂，实验用水为灭菌双重蒸馏水。所有试剂应不含DNA及DNA酶。 4.1 引物 根据Primer 6软件设计，貂源性成分扩增片段为622 bp。 引物序列如下： F：5’-TTAGTAGCTCATAACGCCTTG-3’ R：5’-CGTGAGTATGTTCTTGGTTAG-3’ 使用双蒸水配制为10 μM工作液。 4.2 BstXI限制性内切酶 4.3 PCR Master Mix（或DNA聚合酶、dNTP等PCR试剂） 4.4 基因组DNA提取试剂盒或等效试剂 4.5 裂解缓冲液：250 mmol/L SDS，使用前加入蛋白酶K至100 mg/mL 4.6 TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0 4.7 胶回收试剂盒或等效试剂 4.8 电泳缓冲液：Tris 54 g，硼酸27.5 g，0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）20 mL，加蒸馏水至1000 mL，使用时稀释10倍 4.9 琼脂糖（分子生物学级） 4.10 溴化乙锭（10 mg/mL）或荧光替代染料 4.11 DNA分子量标准（100 bp–1000 bp） 5 仪器设备 5.1 分析天平（0.01 g及0.0001 g） 5.2 台式离心机（12000 r/min） 5.3 水浴锅（28℃–95℃，误差±0.5℃） 5.4 PCR仪 5.5 电泳仪 5.6 凝胶成像系统 5.7 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 6 测定程序 饲料中貂源性成分检测流程包括：样品制备 → DNA提取 → DNA浓度及纯度测定 → PCR扩增及电泳检测 → 酶切及电泳确认。 7 操作步骤 7.1 制样 按GB/T 14699.1采样，取代表性样品1 kg，四分法缩分至约200 g，粉碎后过0.45 mm筛，混匀后备用。 7.2 模板提取 称取50 mg样品于1.5 mL离心管中，加入200 μL TE缓冲液混匀；加入400 μL裂解液及400 μL三氯甲烷混匀，10000 r/min离心5 min取上清；加入0.8倍体积异丙醇沉淀，10000 r/min离心5 min弃上清；用70%乙醇洗涤后晾干；加入50 μL TE溶解DNA沉淀。 也可使用等效DNA提取试剂盒按说明书操作。