ICS 11.220 B41 备案号：49685-2016 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 2591—2016 口蹄疫病毒非结构蛋白单抗阻断ELISA检测方法 Monoclonal antibody blocking ELISA detection method of foot-and-mouth disease virus nonstructural protein antibody 2016-03-18发布 2016-05-18实施 辽宁省质量技术监督局发布 前言 本标准根据GB/T 1.1—2009的有关规定制定。 本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。 本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。 本标准由辽宁省质量技术监督局发布。 本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院、世纪元亨生物技术有限公司。 本标准起草人：杨本勇、赵晓彤、艾纯民、刘坤洋、李井春、杨作丰、张雅为、邓文超、孙明、陈西钊、赵铁柱、夏伟。 1 范围 本标准规定了口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法、判定标准及废弃物处理等技术要求。 本标准适用于猪、牛、羊口蹄疫病毒感染的检测。 2 规范性引用文件 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay） FMDV：口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus） FMDV-NS：口蹄疫病毒非结构蛋白 OD450nm：450nm波长处的吸光值 TMB：3,3',5,5'-四甲基联苯胺 4 检测方法 4.1 器材 量程为100μL的精确微量移液器，200μL 8或12通道微量移液器，一次性移液器吸头，96孔血清稀释板，37℃避光孵育箱，1000mL量筒，振荡器，酶标仪（含450nm滤光片），自动或手动洗板系统，吸水纸等。 4.2 试剂 包被有口蹄疫病毒非结构蛋白抗原的96孔ELISA板；辣根过氧化物酶标记的抗口蹄疫病毒抗原单克隆抗体；PBS-T缓冲液（含0.05% Tween-20，0.01 mol/L，pH 7.4）；含0.1%牛血清白蛋白的PBS-T；TMB底物液及柠檬酸-磷酸盐缓冲液；2 mol/L硫酸终止液等。试剂用水应符合GB/T 6682要求。 样品处理：采集动物全血，待凝固后以4000 r/min离心10 min，收集血清，要求清亮无溶血。 4.3 试验步骤 4.3.1 血清稀释：待检血清按1:1比例与稀释液混合（100 μL稀释液+100 μL血清）。 4.3.2 加样：分别加入阳性对照（2孔）、阴性对照（3孔）及待检样品各100 μL，置37℃孵育60 min。 4.3.3 洗涤：弃液拍干，每孔加满洗涤液静置约30 s，重复洗涤5次。 4.3.4 加酶标抗体100 μL，37℃孵育30 min。 4.3.5 再次洗涤5次。 4.3.6 加底物液A 50 μL及底物液B 50 μL，37℃避光显色10 min。 4.3.7 加入终止液50 μL终止反应。