中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4235—2015 猪戊型肝炎检疫技术规范 Quarantine protocol for swine hepatitis E 2015-05-26 发布 2016-01-01 实施 前言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、上海市动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：鱼海琼、张强、乔彩霞、罗长保、赵吟、蔡先全、刘佩红、周锦萍、李树清、吴晓薇。 1 范围 本标准规定了猪戊型肝炎的临床诊断、酶联免疫吸附试验、实时荧光聚合酶链式反应检测技术。本标准适用于猪戊型肝炎的诊断和流行病学调查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 GB/T 19489 实验室生物安全通用要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 HEV：戊型肝炎病毒 BSA：牛血清白蛋白 HRP：辣根过氧化物酶 OD值：光密度值 ELISA：酶联免疫吸附试验 荧光RT-PCR：实时荧光聚合酶链式反应 4 试剂 4.1 HEV阳性对照血清 4.2 HEV阴性对照血清 4.3 HEV抗原 4.4 牛血清白蛋白 4.5 HRP标记的抗猪IgG 4.6 0.01 mol/L PBS缓冲液 4.7 抗原稀释液（见附录A） 4.8 洗涤液（见附录A） 4.9 吐温-20 4.10 封闭液（见附录A） 4.11 显色剂（见附录A） 4.12 终止液（见附录A） 4.13 TRIZOL 4.14 三氯甲烷 4.15 异丙醇（-20℃预冷） 4.16 0.1% DEPC水 4.17 75% 乙醇 4.18 RNA酶抑制剂（40 U/μL） 4.19 Taq DNA聚合酶（5 U/μL）及相应10X缓冲液 4.20 M-MLV反转录酶（200 U/μL）及相应5X反转录反应缓冲液 4.21 dNTP（2.5 mmol/L） 4.22 MgCl2（25 mmol/L） 5 设备 5.1 二级生物安全柜 5.2 高压灭菌锅 5.3 微量移液器 5.4 酶标仪 5.5 洗板机 5.6 高速冷冻离心机 5.7 荧光PCR仪 6 临床诊断 6.1 流行病学 戊型肝炎的流行病学特点与甲肝相似，参见B.1。 6.2 临床症状及病理变化 猪自身感染HEV临床症状并不明显，参见B.2。 6.3 初步诊断 根据临床症状、病理变化和流行病学可以作出初步判断，进一步诊断应采集样品进行实验室检测。该病原属人畜共患病原，涉及病原的检测应在二级生物安全实验室进行，样品保存和废弃物处理应按照GB/T 19489生物安全要求进行。 7 实验室检测 7.1 酶联免疫吸附试验（间接ELISA） 7.1.1 原理 96孔微量板的奇数列包被有戊型肝炎病毒衣壳蛋白重组抗原，偶数列则未包被。检测样品和对照样品加入到反应孔内，每个样至少加平行的两孔（一个奇数孔和一个偶数孔）。如果血清中存在特异性抗体，会形成抗原-抗体复合物。洗板后，加入HRP标记的酶结合物，该酶标结合物与HEV抗原抗体复合物结合，形成抗原-抗体-酶复合物。洗去过剩的酶结合物，加入底物液，样品中特异性抗体的数量就会在奇数、偶数孔间出现颜色差异：如果存在抗体，加入终止液后蓝色液体会变成黄色；如果没有抗体，则无色。 7.1.2 样品采集制备 按照GB/T 18088，无菌操作采集动物血，每头不少于5mL，自然凝固后无菌分离血清，分装，加盖密封后冷藏保存。样品1周内检测可存放于2℃～8℃，超过1周应置于-20℃。 7.1.3 操作步骤 7.1.3.1 使用前将所有试剂平衡至室温（21±5）℃，将反应板/条做好标记，阴性对照孔A1、A2、B1、B2，阳性对照孔C1、C2、D1、D2。 7.1.3.2 用多通道移液器加190μL样品稀释液至所有样品孔。 7.1.3.3 加10μL阴性对照至A1、A2、B1、B2孔，加10μL阳性对照至C1、C2、D1、D2孔；加10μL待检血清到其他剩余的