中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4163—2015 国境口岸拉沙热病毒荧光PCR检测方法 Real time PCR detection methods of Lassa fever virus at ports 发布日期：2015-02-09 实施日期：2015-09-01 归口单位：国家质量监督检验检疫总局 前言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中国科学院武汉病毒研究所。 本标准主要起草人：师永霞、史蕾、卓锦雪、丁国允、郑、袁志明、黄吉城、李小波、幸芦琴、洪烨、孙薇、黄弋、钟玉清、相大鹏、郭波旋。 引言 由于目前可获得的拉沙热病毒毒株之间基因变异比较大，难以找到所有毒株均保守的基因片段，本标准选用的引物及探针只是针对近十多年来世界各地发现的毒株的序列信息所设计，并不能保证所有不同地理来源的拉沙热病毒均可检出，特此说明。 1 范围 本标准规定了国境口岸拉沙热病毒检测的生物安全要求、标本的采集、运输和保存、标本的处理，以及拉沙热病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法。本标准适用于国境口岸人出境疑似拉沙热病毒感染对象的实时荧光 RT-PCR 检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 人间传染的病原微生物名录（卫生部） 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 拉沙热病毒 (Lassa fever virus) 属于沙粒病毒科，病毒直径约 80nm~150nm（平均 100nm），有包膜。拉沙热病毒的基因组为 2 条单股负链 RNA（S 和 L），S 片段全长 3.5kb，编码病毒的核蛋白（NP）和包膜糖蛋白（GP1、GP2）；L 片段全长 7.2kb，编码病毒 RNA 多聚酶和 Z 蛋白。 3.2 拉沙热 (Lassa fever) 是由拉沙热病毒引起、主要经啮齿类动物传播的一种急性传染病。临床表现主要为发热、寒战、咽炎、胸骨后疼痛和蛋白尿，可出现多系统病变。本病主要在几内亚、利比里亚、塞拉利昂和尼日利亚等西非国家流行。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 实时荧光 RT-PCR：实时荧光反转录-聚合酶链反应 Ct 值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 RNA：核糖核酸 FAM：FAM 荧光染料，一种荧光报告基团 5 生物安全要求 拉沙热病毒相关材料的实验活动按照 GB 19489 和《人间传染的病原微生物名录》中的生物安全要求进行。 6 标本的采集、运输和保存 6.1 人血清 无菌采集疑似病例发病 14d 内静脉血 3mL~5mL，室温静置 30min 使其凝固，500×g 离心 10min，收集血清于 2mL 无菌螺口塑料管中，用耐低温油性记号笔记上编号，低温送到实验室检测。如 24h 内不能送到实验室，将血清置于 -70℃ 保存。 6.2 鼠排泄物 将鼠液体排泄物 2mL 或固体排泄物 2g 装至有螺旋帽的无菌管中，用耐低温油性记号笔记上编号，低温运输或 -70℃ 以下保存待检。 6.3 鼠体标本 无菌解剖可疑染毒鼠后，收集鼠脏器于有螺旋帽的无菌管中，用耐低温油性记号笔记上编号，低温运输或 -70℃ 以下保存待检。 7 拉沙热病毒的实时荧光 RT-PCR 检测 7.1 主要仪器 本方法使用的主要仪器包括：荧光定量 PCR 仪、超净工作台、ⅡA 级生物安全柜、高压灭菌锅、低温高速离心机（最大离心力 20000×g）、漩涡振荡器、冰箱（4℃、20℃ 和 -70℃）和移液器等。 7.2 主要试剂 本方法使用的主要试剂包括：核酸提取试剂（如 Qiagen 公司的 QIAamp Viral RNA Kit）、实时荧光 RT-PCR 通用试剂（如 Ambion 公司的 Ag-Path-IDT One-step RT-PCR Kit）、PBS 溶液（pH 7.0）、无 RNA 酶的 DEPC 水和探针等。 表 1 拉沙热病毒实时荧光 RT-PCR 检测的引物和探针序列 (5'-3') - Lf1-FP: CTCATGGGATTGATGTCACAGA - Lf1-RP: CGAGGGAGTGCTTCTATAACTGC - LP1: FAM-acctggc+Tgtgc+Agcaaac-BHQ1 - Lf2-1: AAGG (序列不完整)