中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4097—2015 贝类派琴虫实时荧光PCR检测方法 Real-time fluorescent PCR quarantine protocol for Perkinsus sp. in shellfish 发布日期：2015-02-09 实施日期：2015-09-01 国家质量监督检验检疫总局 前言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：张雪、肇慧君、李叶、李振荣、贾。 1 范围 本标准规定了贝类中派琴虫的实时荧光PCR检测方法。本标准适用于贝类组织中派琴虫的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实时荧光PCR (Real-time fluorescent PCR) 在普通聚合酶链反应的基础上加入一条特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，达到实时定量的目的。 3.2 Ct值 (Cycle threshold) 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，也可称为Cp值。 4 试剂和材料 4.1 1 mol/L Tris·Cl (pH 8.0)、0.5 mol/L EDTA 溶液 (pH 8.0)、SDS (10%)。溶液配制见附录A。 4.2 蛋白酶K溶液 (20 mg/mL)。 4.3 苯酚—饱和酚。 4.4 三氯甲烷。 4.5 异戊醇。 4.6 无水乙醇。 4.7 生理盐水。 4.8 10×PCR buffer、25 mmol/L MgCl2、2.5 mmol/L dNTP、5 U/μL Taq酶。 4.9 10 μmol/L 上游引物、10 μmol/L 下游引物、10 μmol/L 探针。 4.10 TE 缓冲液 (pH 8.0)。 5 仪器和设备 5.1 组织研磨器。 5.2 电子天平。 5.3 冷冻离心机。 5.4 涡旋振荡器。 5.5 水浴锅。 5.6 超纯水机。 5.7 冰箱 (2℃～8℃、-20℃、-80℃)。 5.8 高压灭菌锅。 5.9 实时荧光PCR仪。 6 检测步骤 6.1 取样 选取濒死的新鲜贝类样品，或者有感染派琴虫临床症状的样品（消化腺发白，贝壳不能闭合，套膜收缩，性腺发育受到抑制，生长迟缓等）。采集贝类的腮、套膜和消化腺等组织25 mg，置于冰冷的生理盐水中反复冲洗，用滤纸吸干表面水分，在液氮中冻5 min，放至室温，再置于匀浆研磨器中并加入冷的生理盐水50 μL，进行手工匀浆研磨。 6.2 DNA提取和纯化 6.2.1 将匀浆液倒入1.5 mL离心管中，加入生理盐水补充体积至200 μL，加入20 μL 蛋白酶K (20 mg/mL)，再加入SDS至终浓度为1%，上下颠倒混匀。 6.2.2 将混合液置于55℃水浴锅内水浴2.5 h。 6.2.3 向匀浆液中按1:1比例加入苯酚：三氯甲烷：异戊醇混合液，上下颠倒混匀，12000 r/min离心5 min。 6.2.4 转移上层水相，加入等体积三氯甲烷：异戊醇混合液，上下颠倒混匀，12000 r/min离心5 min。 6.2.5 转移上层水相，加入两倍体积的无水乙醇，-20℃放置30 min或过夜。12000 r/min离心5 min，沉淀DNA，倾去上清液。 6.2.6 于沉淀中加入75%乙醇溶液500 μL，轻轻混匀后12000 r/min离心5 min，倾去上清液，室温下用20 μL TE缓冲液溶解DNA沉淀，-20℃保存备用。 6.2.7 组织DNA提取也可采用等效的商品化DNA提取试剂盒，按照说明书进行操作。 6.3 实时荧光PCR检测 6.3.1 实时荧光PCR引物 该引物扩增派琴虫核糖体DNA序列中的ITS区域基因序列，扩增片段长度为69 bp，参见附录B。上游引物：5'-TCAAAACGAAATTCCAAACTCTCA-3'；下游引物：5'-CTTCG