中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4076—2014 百合无症病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of lily symptomless virus 发布日期：2014-11-19 实施日期：2015-05-01 发布机构：中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：廖富荣、沈建国、方志鹏、林石明、吴媛、陈青、陈红运、黄蓬英。 1 范围 本标准规定了百合无症病毒免疫学、分子生物学检疫鉴定方法。本标准适用于百合属、印加百合属、郁金香属、水鬼蕉属等寄主植物的鳞球茎、叶片中百合无症病毒的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T 2119 进境观赏鳞球茎检疫操作规程 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 百合无症病毒 英文名称：lily symptomless virus 缩写：LSV 同种异名：lily streak virus, lily symptomless carlavirus, lily curl stripe virus, Alstroemeria carlavirus, Alstroemeria latent virus, lily virus。 分类地位：芜菁黄花叶病毒目（Tymovirales）、β线状病毒科（Betaflexiviridae）、香石竹潜隐病毒属（Carlavirus）。 传播途径：经蚜虫非持久性传播、机械传播和种球传播。LSV的其他信息参见附录A。 4 方法原理 百合无症病毒（LSV）的免疫学、分子生物学特征是制定本检疫鉴定方法的主要依据。 5 主要仪器设备及用具 植物汁液提取仪、酶标仪、洗板机、微量天平（感量：0.001g）、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽或恒温孵育器、pH计、各种量程的可调移液器（1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL、2μL）。 6 主要试剂 血清学试剂见附录B，分子生物学试剂见附录C和附录D。 7 检测与鉴定 7.1 抽样检查 按照SN/T 2119、SN/T 2122给出的方法进行抽样、取样。 7.2 血清学检测（DAS-ELISA方法） 按附录B给出的方法进行检测。用LSV已知分离物作阳性对照，健康叶片作阴性对照，样品提取缓冲液作空白对照。 7.3 分子生物学检测 7.3.1 RT-PCR检测 按附录C给出的方法，提取样品总RNA，进行RT-PCR检测。用LSV已知分离物作阳性对照，健康叶片作阴性对照，并设置空白对照。 7.3.2 实时荧光RT-PCR检测 按附录D给出的方法，提取样品总RNA，进行实时荧光RT-PCR检测。用LSV已知分离物作阳性对照，健康叶片作阴性对照，并设置空白对照。 7.3.3 序列测定与分析 将PCR产物回收后，进行克隆、测序，或者PCR产物直接测序（序列测定可由专业的生物公司完成）。把测定的核苷酸序列与已知的LSV相应序列进行比对，如果与已知的LSV相应序列具有高度同源性，则判定为LSV序列，否则为非LSV序列。 注1：序列比对可利用NCBI网站上的BLAST软件进行，网址为 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。 注2：国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV）关于香石竹潜隐病毒属（Carlavirus）种类区分标准之一：外壳蛋白或聚合酶基因核苷酸序列同源性低于72%（或氨基酸低于80%）。 8 结果判定 采用DAS-ELISA进行初筛检测，当检测结果为阴性时，则判定未检出百合无症病毒（LSV）。 当检测结果为阳性时，用分子生物学方法进行验证： - 当RT-PCR或实时荧光RT-PCR方法检测结果为阴性时，则判定未检出百合无症病毒（LSV）； - 当RT-PCR或实时荧光RT-PCR方法检测结果为阳性时，则判定检出百合无症病毒（LSV）。 采用RT-PCR方法进行初筛检测，当检测结果为阳性时，则进行序列测定分析：当测定的序列为LSV序列时，则判定为检出百合无症病毒（LSV）。