中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3750—2013 苹果壳色单隔孢溃疡病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Botryosphaeria stevensii Shoemaker 2013-11-06 发布 中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 2014-06-01 实施 前言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草，由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：王卫芳、张秋娥、黄英、严进、华丽。 1 范围 本标准规定了植物检疫中苹果壳色单隔孢溃疡病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于苹果壳色单隔孢溃疡病菌所有寄主植物的原木、枝条、苗木和果实的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 原理 依据苹果壳色单隔孢溃疡病菌的为害症状、菌落特征、病菌的无性型和有性型形态进行该病菌的检疫鉴定。 4 试剂及仪器设备 4.1 培养基及试剂 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA：每 1000ml PDA 由 200g 去皮马铃薯，20g 葡萄糖，18g 琼脂配制而成）、燕麦琼脂培养基（OA：每 1000ml OA 由 30g 燕麦片，20g 琼脂配制而成）、100% 乳酸、1% 的次氯酸钠（NaOCl）、70% 乙醇、无菌水。 4.2 仪器与设备 立体显微镜、生物显微镜（具油镜和测微尺）、普通天平（感量 0.1g）、超净工作台、生物培养箱、高压灭菌器、载玻片、盖玻片、打孔器（直径 4mm）。 5 检疫与鉴定 5.1 症状检查 检查抽取的原木、木制品、枝条和苗木树皮的表面是否有溃疡，枝条是否有枯死症状，检查果实是否有腐烂症状（症状描述和图片参见 A.3、图 B.1）。按 SN/T 2122 抽样，将有可疑症状的样品带回实验室作进一步检验。 5.2 实验室鉴定 5.2.1 样品中的病菌形态学观察 从树皮上采集子实体，横切片后，将切片组织转移到滴有无菌水的载玻片上，在常温下晾干后加 1 滴 100% 乳酸并盖上盖玻片，制成非永久性玻片。观察子实体（尤其是子座）的形态特征，记录分生孢子、产孢细胞或者子囊、子囊孢子的形态。分别测量 50 个子囊孢子、子囊、分生孢子和产孢细胞、10 个无性型子座和 10 个有性型子座的大小，拍摄并保存数码照片，同时将子实体转入培养基中纯化保存。 5.2.2 分离培养 在样品中如果没有发现病原菌的子实体，则采用组织分离培养法，分离病部的病原菌。取发病部位的病健交界组织，切成 4mm × 4mm 的小块，用 1% 的 NaOCl 表面消毒 10min，无菌水冲洗 3 遍，置于直径 9cm 的 PDA 平板上，每皿放 4～6 块，于 25℃ 条件下 12h 黑暗/光照培养，将长出的菌落边缘的菌丝转至新的 PDA 平板上纯化。 5.2.3 分离物培养性状和形态学观察 将纯化后的菌株在 PDA 平板上培养 6d，采用火焰消毒的打孔器从菌落上打取直径 4mm 的菌丝体块，转移到新的 PDA 平板上，在全黑暗条件下，分别于 20℃、25℃ 进行培养，每处理重复 3 次，观察菌落形态、计算菌落的生长速度、分生孢子器形成的速度。待分生孢子器形成后，观察分生孢子器及分生抱子的形态，测量其大小，拍摄并保存数码照片。 6 鉴定特征 6.1 菌落特征 在 PDA 平板上，菌落圆形，初期白色，培养 5d～6d 后呈深橄榄色，且有大量的气生菌丝生成，在 20℃、25℃ 黑暗条件下菌落生长速率分别为 6mm/d、11mm/d。培养至 6d 菌落中央即现纠结成粒状的大量黑褐色分生孢子器。培养至 9d 少量的分生孢子器顶部即现白色黏稠状分生孢子团，培养至 15d 整个培养皿布满黑褐色分生孢子器，并且喷出大量白色孢子团（菌落特征图参见图 B.2）。 6.2 无性繁殖器官的形态 分生孢子器，单生或聚生，埋生于黑色的子座上，成熟时部分开裂，深褐色至黑色，近球形，直径可达 600μm，壁由三层组成，外层黑褐色，由厚壁细胞组成，中间层由深褐色的薄壁细胞组成，内层由透明的薄壁细胞组成。孔口居中，圆形，具乳突。分生抱子梗圆柱形，透明，无隔膜，极少数分支具隔膜。产孢细胞 [(11～15)μm × (4～5)μm]，外生芽殖型产孢，离散，圆柱形，透明，光滑，无限生长。分生孢子器成熟后喷射出白色分生孢子团。分生孢子透明，光滑，厚壁，长椭圆形至卵形，大小 [(23.5～27.4)μm × (12.4～14.3)μm]。